Isolatie en detectie van virussen

[Verwijderd]

Ik ben bezig met het bepalen van de algemene microbiologische gesteldheid van snoezelballen (ja die ballen van een ballenbak ) en tevens wil ik het effect van een desinfectant testen.

nu vroeg ik me af of er een (eenvoudige) manier is om virussen aan te tonen. Ik d8 zelf: eerst isoleren en vervolgens op één of andere wijze kleuren. Op internet heb ik al wat gelezen over een swab-methode voor virussen maar of dit een goede methode is weet ik niet . Het mooiste zal zijn als ik vervolgens de virussen kwantitatief kan bepalen.

Met virussen bedoel ik virussen in het algemeen en niet een bepaald soort. Het gaat vooral om rotavirussen omdat deze voor de mens tot gevaar kunnen zijn.

Ik zoek dus een kwantitatieve of een kwalitatieve detectie methode voor virussen op een droog oppervlak.

Alvast bedankt.

[Elvhenk]

Interessant, ben benieuwd naar de uitkomst. Geen nuttige bijdrage te bieden. Ja die ballenbakken schijnen volgekleefd te zitten met diverse "ongelukjes" uit diverse lichaamsopeningen...

[Lord Daemon]

Uhm... ik kan me nauwelijks voorstellen dat hier een goedkope methode voor bestaat. Vraag het aan Jag, Unicorn, Diadem of Captain Proton. Als iemand het hier weet zijn zij het.

Lord Daemon

[Unicorn]

Nou streep mij maar uit dat rijtje weg, want ik weet het dus niet.

[Alkaline]

Volgens mij kan dit niet. Weet je wel hoe klein een virus is? Je hebt er op z,n minst een electronenmicroscoop voor nodig als je ze wilt zien. Of je moet antigenen aan tonen. Maar dat is met monsters van levende wezens. Verder weet ik er ook niet meer van.

Ik denk dat Lord Daemon gelijk heeft dat het niet goedkoop wordt wat je wilt uitvoeren.

[Verwijderd]

Ik denk dat je een antigen-antibody reactie moet gebruiken, waarbij dat antibody gelabeld is, met een radioactief metaal of een fluorescerende stof, maar dit wordt duur... en is heel moeilijk uit te voeren.

Bacterien zijn gemakkelijk, maar virussen zijn en blijven lastig.

[-=Confuzer=-]

hhmmm electrolyse na kweek op antigenen...

ELISA bv bij AIDS...

Verder weet ik het ook niet...
Elektronen microscoop is handig ja... (en nog mooie plaatjes ook)

Weet je zeker dat je virussen moet gaan zoeken en niet bacterien ?

(ik ben zelf alleen maar tot het kleuren van bacterien toegekomen... virussen kleuren heb ik nog nooit gedaan, maar een plaatje ervan lijkt me leuk...
missschien immunoperoxidase staining? daar heb ik leuke plaatjes van in The Pap Smear)

[Verwijderd]

<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>hhmmm electrolyse na kweek op antigenen...[/quote]ehhh... kan je dit effe uitleggen?<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>Verder weet ik het ook niet...
Elektronen microscoop is handig ja... (en nog mooie plaatjes ook)[/quote]maar met een electronenmicroscoop gaan zoeken naar virussen is nog net iets moeilijker dan met een verrekijker gaan zoeken naar aliens op andere planeten... (al hoef je daar de aarde niet voor af. Een beetje spaans spreken is voldoende voor een positieve identificatie )<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>virussen kleuren heb ik nog nooit gedaan, maar een plaatje ervan lijkt me leuk...
missschien immunoperoxidase staining? daar heb ik leuke plaatjes van in The Pap Smear)[/quote]Wat? je kan virussen niet zien met een lichtmicroscoop, en dan heeft kleuren lekker weinig zin...

[Verwijderd]

Fijn al die reacties: stel ik zeer op prijs.

Ik zie al dat het vrijwel onmogelijk is om met die virussen te gaan stoeien en zeker met de tijd die wij krijgen om het project af te ronden.

Dan gaan we wel aan de gang met bacterien .

Nog ff wat info voor de liefhebbers:

We gaan voor de isolatie van bacterien, schimmels en gisten de alignaat swab methode gebruiken. Deze methode gaan we eerst nog valideren m.b.v. ballen die we zelf hebben besmet (we weten hiervan ongeveer de populatie grootte).

Vervolgens kijken we naar de algemene microbiologische gesteldheid van de ballen afkomstig van bijv. MC DONALDS . Hiervoor gebruiken we allereerst de alignaat swab. We groeien de micro-organisme op, op een algemeen medium bij kamertemp. Vervolgens moeten we bacterien, gisten en schimmels gaan aantonen/uitsluiten. Als iemand hiervoor nog een idee heeft laat het me weten .

En we kijken naar het effect van de desinfectanten Oxonia en Symatox D4 (laatste is nog niet zeker). We doen dit d.m.v. kiemgetalbepalingen.

Mocht iemand toch nog een idee hebben voor de oorspronkelijke vraag dan sta ik daar voor open .

[-=Confuzer=-]

beetje zoals de anigen-antilichaam reactie maar dan zonder radioactief materiaal, je ziet het zo al...

Enne met immunoperoxidase maak je zichtbaar/duidelijk dat er een virus infectie is...

Of ze nu de gevolgen ervan kleuren of de virussen zelf weet ik niet, ik trok idd een te vroege conclusie...

Maar ik zie hier mooie elektronen microscoop plaatjes van virussen... als het een grote infectie is zijn ze vrij makkelijk te vinden zo te zien...

[Verwijderd]

<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>zoals de antigen-antilichaam reactie maar dan zonder radioactief materiaal, je ziet het zo al...[/quote]Zoiets als: eerst antigen/antibody reactie uitvoeren en dan scheiden met electroforese? Zou kunnen werken, ik ken die techniek niet...<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>Enne met immunoperoxidase maak je zichtbaar/duidelijk dat er een virus infectie is...
Of ze nu de gevolgen ervan kleuren of de virussen zelf weet ik niet, ik trok idd een te vroege conclusie...[/quote]de gevolgen. Want virussen zelf kleuren is totaal nutteloos, of het moet een infectie zijn in een zeer vergevorderd stadium.<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>Maar ik zie hier mooie elektronen microscoop plaatjes van virussen... als het een grote infectie is zijn ze vrij makkelijk te vinden zo te zien...[/quote]Dit is geen infectie... het gaat hier om losse virussen in een ballenbak! Die vind je nooit...

[-=Confuzer=-]

electroforese idd...

I just don't have my day...

Ik bedoel net als ELISA bij aids, die heb ik wel eens zelf uitgevoerd. (zoek maar ff op hoe dat gaat, ik ben te lui)

[Verwijderd]

<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>Dit is geen infectie... het gaat hier om losse virussen in een ballenbak! Die vind je nooit...[/quote]je moet eerst de virussen overbrengen op een geschikt medium om ze verder op te kweken, zodat je na een tijdje wel meer virussen hebt. omdat het virussen zijn kun je ze alleen in levende cellen opkweken.
je moet er ook rekening mee houden dat bepaalde virussen vrij makkelijk kapot gaan als ze zich niet in een geschikte vloeistof bevinden. al geld dit niet voor alle soorten even sterk. als een virus eenmaal kapot is kun je het natuurlijk niet meer eerst opkweken in cellen, dus zul je het dan aan moeten tonen met zeer kleine hoeveelheden. dat is veel moeilijker of zelfs onmogelijk bij bepaalde technieken.
bijvoorbeeld als je met radioactiviteit (niet meer in de catagorie goedkoop) gaat werken. als je te weinig radioactieve stof gebruikt, kun je het niet aantonen op een "foto"

[Verwijderd]

<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>je moet eerst de virussen overbrengen op een geschikt medium om ze verder op te kweken, zodat je na een tijdje wel meer virussen hebt. omdat het virussen zijn kun je ze alleen in levende cellen opkweken.[/quote]probleem is dan: hoe weet je dat de virussen die je inbrengt ook in het ballenbad zaten? En hoe haal je uberhaupt virussen uit een ballenbad? virussen vormen niet net zoals bacterien mooie kolonies...

Met radioactiviteit kan je nog wel veel specificiteit behalen, maar dan is het niet goedkoop meer nee... en dat probleem blijf je houden.
Virussen aantonen buiten levend weefsel is gewoon heel moeilijk

[-=Confuzer=-]

<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>probleem is dan: hoe weet je dat de virussen die je inbrengt ook in het ballenbad zaten? En hoe haal je uberhaupt virussen uit een ballenbad? virussen vormen niet net zoals bacterien mooie kolonies...[/quote]Je brengt geinfecteerde cellen over op een laagje cellen in een petri-schaaltje. Voila...

En als je het steriel genoeg aanpakt is het vrijwel zeker dat het virus van de ballen af kwam...

[Verwijderd]

<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>Je brengt geinfecteerde cellen over op een laagje cellen in een petri-schaaltje. Voila...
En als je het steriel genoeg aanpakt is het vrijwel zeker dat het virus van de ballen af kwam...[/quote]het ging hier toch om virussen die los voorkomen in een ballenbad? Dus waar komen dan die geinfecteerde cellen vandaan?
Of je moet eerst cellen infecteren met vuil ofzo uit het ballenbad. Maar daarbij heb je totaal geen controle over wat je in de cellen stopt...
De enige manier zou dan zijn door centrifugeren alle cellen verwijderen. Maar dan nog heb je allerlei virussen en andere rotzooi, die je niet kan scheiden.

[-=Confuzer=-]

Virussen die los voorkomen of geinfecteerde cellen... dat maakt niet uit...

[Verwijderd]

Dus jij gaat losse virussen overbrengen in een petrischaaltje en ze dan opkweken...

Leg dan eens uit, hoe ga je de virussen vinden in dat ballenbad?

[Verwijderd]

het idee van goedkoop kunnen we beter loslaten, dat gaat toch niet lukken (tenzij je "vrijwilligers" gaat besmetten met vuil uit het ballenbad en dan gaat kijken of ze symptomen ontwikkelen die horen bij een bepaald ziektebeeld. maar dit houdt je alleen goedkoop als de slachtoffers je echt niets kunnen maken.. oftewel, dit is absoluut geen mogelijkheid.)

om zo'n virus op te kweken moet je eerst steriel een kweek maken van cellen die er gevoelig voor zijn. die besmet je vervolgens met vuil uit het ballenbad. daar kunnen dan de virussen tussen zitten, in elk geval komt elke schadelijke factor uit het ballenbad zelf. als het virus er tussen zit (en nog niet kapot gegaan is) heb je hier na verloop van tijd veel meer van en kun je er makkelijker andere technieken op loslaten.
als je van te voren al andere schadelijke factoren uit het vuil kunt halen, is dat natuurlijk beter, maar het is niet perse noodzakelijk, zo lang die maar niet voor de dood van je kweek zorgen. je kunt naderhand gaan kijken of het virus er in zit of niet, door naar bepaalde specifieke antigenen te zoeken.

je zult ws geen geinfecteerde cellen in het ballenbad aantreffen, maar losse virusdeeltjes kan wel. die zitten tussen het andere "vuil"

[Verwijderd]

el marcianito

Dit zou een manier kunnen zijn. alleen, wanneer je de cellen gaat infecteren met vuil uit en ballenbad, breng je zeker bacterien over. En die winnen het waarschijnlijk wel van zo'n virus...
Dus moet je de bacterien en allerlei eukaryote eencellige en meercellige organismen eruit halen als je op virussen wilt testen. Dit is al helemaal niet makkelijk, maar stel dat het lukt...

Dan heb je dus een mengsel van anorganische stof, misschien nog wat brokstukken van levende weefsels en als je geluk hebt wat virussen. Je hebt nog steeds het probleem dat een hoop van die stoffen schadelijk zijn voor de testcellen, maar goed, als je DAAR ook een oplossing voor vindt, en je krijgt het virus zo ver dat ie ook de testcellen nog infecteert, dan zou je iets kunnen bereiken.

Al heb je voor het isoleren van de antilichamen wel een goed idee nodig welk virus je precies zoekt...

niet makkelijk dus, en ik denk ook niet dat het de moeite waard is...

[Verwijderd]

ok ik heb niet gezegd dat het zo makkelijk is of dat het echt de moeite waard is om op deze manier een ballenbad te gaan onderzoeken. maar gewoon om de mogelijkheid...<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>En die winnen het waarschijnlijk wel van zo'n virus...[/quote]die cellen hebben op een heel andere manier last van bacterien dan van virussen. bacterien produceren mogelijk toxines en concurreren om voedsel. virussen dringen de cel binnen om zich daar te laten copieren en zo vermenigvuldigen, waarbij de gastheer meestal het loodje legt.<BLOCKQUOTE><font size=1 face=Verdana, Arial, Helvetica>quote:</font><HR>Al heb je voor het isoleren van de antilichamen wel een goed idee nodig welk virus je precies zoekt...[/quote]dat moest je van te voren ook al hebben, want anders kun je niet bepalen welk soort cellen je moet kweken waar je virus in kan binnendringen.
als je ze niet in afweercellen kweekt, kun je ook geen antilichamen aantreffen in je celkweek. je moet opzoeken wat voor specifieke antigenen er op je virus zitten en die dan toevoegen (bijv radioactief gelabelled)
als je wil kijken wat voor antilichamen een organisme ertegen produceert zul je toch moeten inspuiten. en dan de b-lymfocyten isoleren en verder bewerken.

en voeg nog maar toe aan je moeilijkheden: veel virussen zijn na redelijk korte tijd "kapot", waarna ze geen cellen meer kunnen infecteren.

[Verwijderd]

Als je nou heel zeker bent dat je virussen hebt geisoleerd dan is het in theorie toch mogelijk om:

DNA en RNA van deze virussen te isoleren

RNA en om te zetten in DNA m.b.v. transcriptase

Met de PCR techniek een grotere DNA concentratie te verkrijgen.

En tot slot DNA te detecteren.

Kan dit een methode zijn om semi-kwantitatief virussen aan te tonen???

[Verwijderd]

Ja...

als je een lab tot je beschikking hebt waar ze dit allemaal kunnen en je heel zeker weet dat dat dna uit de virussen komt...

Maar als je heel zeker weet dat je virussen hebt geisoleerd, waarom zou je ze dan nog aantonen?

[Verwijderd]

Ik bedoel als je een methode hebt waarvan je zeker weet dat deze alleen virussen isoleerd en dat je dus niet in hoeft te zitten over DNA van bacterien, schimmels en/of gisten.

Aangezien het nog niet bewezen is of er daadwerkelijk virussen op/in/onder je monstermateriaal zit is het dus misschien makkelijk om DNA te detecteren (zie vorige post).

Het streven is een 'eenvoudige' kwantitatieve methode voor virusbepaling.

De concentratie van het DNA kan men spectrofotometrisch bepalen.

Probleem: is deze concentratie te koppelen aan de hoeveelheid virussen die geisoleerd zijn.

Ik zie nog een probleem maar dat is een praktische: wat nou als er vrij DNA/RNA op het monstermateriaal zit.

Wie Wie.

[Verwijderd]

laat ik nog een praktisch probleem toevoegen: als je pcr wil toepassen, heb je primers nodig, die aan het begin van de keten aanhechten, want dna polymerase II (of een enzym met dezelfde activiteit) kan alleen maar een keten verlengen, niet beginnen je moet dan wel precies weten hoe het begin van de keten eruit ziet. dit kan eigenlijk alleen als je al precies weet welk virus je aan het zoeken bent en weet hoe zijn dna/rna eruit ziet.
als je een vrij lange primer gebruikt, kun je een zeer grote specifiteit bereiken, waardoor alleen dna gevormd wordt wat bij een bepaald virus hoort. "vervuiling" in de zin van dna van andere organismen/virussen wordt dus niet gecopieerd. blijft de vraag
waar je dna vandaan kwam..